实验目标：理解光谱分析技术原理，理解光合色素提取和分离的原理，学习分光光度计的工作原理；学会提取植物体色素的方法，学会分离各种不同色素的方法，理解色素的物理化学性质，加深对其生理功能的理解；学习吸收曲线的做法；学会分光光度计的使用；了解不同植物的叶绿素含量的差异；学会利用分光光度法测定叶绿素含量。
实验原理：叶绿体色素是植物进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。植物光合色素溶于有机溶剂，不溶于水。叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受到强光破坏，分子中的镁可被氢取代而生成去镁叶绿素，加入铜盐后，可生成铜代叶绿素，铜代叶绿素在光下较稳定。叶绿体色素具有光学性质，可以测定其吸收光谱，作出吸收曲线。
叶绿素a和叶绿素b的光谱吸收锋虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此又有重叠，这种情况下，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。OD1=Ca*Ka1+Cb*Kb1 (1)
OD2=Ca*Ka2+Cb*Kb2 (2)
式中，Ca为组分a(叶绿素a)的浓度；
Cb为组分b(叶绿素b)的浓度；
OD1为波长为663nm（叶绿素a的吸收峰），混合液的光密度值；
OD2为波长为645nm（叶绿素b的吸收峰），混合液的光密度值；
Ka1为组分a(叶绿素a)的比吸收系数；即组分a(叶绿素a)的浓度为1g/L时，其在波长为663nm时的光密度值；
Ka2为组分a(叶绿素a)的比吸收系数；即组分a(叶绿素a)的浓度为1g/L时，其在波长为645nm时的光密度值；
Kb1为组分b(叶绿素b)的比吸收系数；即组分b(叶绿素b)的浓度为1g/L时，其在波长为663nm时的光密度值；
Kb2为组分b(叶绿素b)的比吸收系数；即组分b(叶绿素b)的浓度为1g/L时，其在波长为645nm时的光密度值；
文献中查到叶绿素a、叶绿素b的比吸收系数如下表：
波长/nm 叶绿素a 叶绿素b
663 82.04 9.27
645 16.75 45.6
将表中数值代入上式（1）、（2），经整理，得到下式：
Ca＝0.0127 OD1－0.00269 OD2
Cb＝0.0229 OD2－0.00468 OD1
如果把Ca 、Cb的单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：
Ca＝12.7 OD1－2.69 OD2 (3)
Cb＝22.9 OD2－4.68 OD1 (4)
Ct＝Ca+Cb＝8.02 OD1+20.21 OD2 (5)
式中，Ct为总叶绿素的浓度，单位是mg/L。
利用式（3）（4）（5）可以计算叶绿素的量。
实验用具：分光光度计，台天平，分液漏斗，剪刀，研钵，酒精灯，试管架，试管，试管夹，量筒，移液管，滤纸，漏斗，容量瓶
丙酮，乙醚，盐酸，醋酸铜，甲醇，氢氧化钾，四氯化碳，石英砂，碳酸钙，
实验材料：菠菜或其它绿色叶片
实验步骤：
1． 提取叶绿体色素
取2g绿色叶片，剪碎，置于研钵内。加入少许碳酸钙、石英砂、丙酮，研磨后将溶液过滤到容量瓶中。反复进行，至残渣呈白色。丙酮定容至20ml，为叶绿体色素提取液。
2． 叶绿体色素提取液用于以下内容：
（1）荧光现象的观察； 取色素提取液少许于试管中，分别观察在反射光和投射光一侧，提取液的颜色有何不同。反射光侧观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光颜色。
（2）光对叶绿素的破坏作用； 取色素提取液少许分装于两支试管中，1支试管放于黑暗处，另一支置于强光下，经2～3小时后，观察两支试管中的溶液颜色有何不同。
（3）叶绿素的取代作用； 取色素提取液少许于试管中，1滴1滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色，即形成铜代叶绿素。
（4）黄色素与绿色素的分离； 取色素提取液10ml,加到盛有20ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液即分为两层。色素转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1～2次。然后于色素乙醚溶液中加入5ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10分钟，再加约10ml蒸馏水，摇动后静置分离，得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。
3． 叶绿体色素的光学性质
叶绿体色素提取液取1ml稀释至10ml。在7220型分光光度计上，从480nm～700nm，每隔10nm测定OD值，在标准方格纸上作出 吸收曲线。
4． 叶绿素含量的测定
叶绿体色素提取液取1ml稀释至10ml。在7220型分光光度计上，读取645nm和663nm波长下的OD值。进行如下计算：Ca=12.7OD663－2.69OD645
Cb=22.9 OD645－4.68 OD663
Ct=Ca+Cb 单位：mg/L
思考题：（1）测定叶绿素的含量时，选择的是叶绿素a和叶绿素b在橙红光区的吸收峰，可不可以选择叶绿素a和叶绿素b在篮紫光区的吸收峰?为什么？
（2）比较资料上光合作用的作用光谱与叶绿素a的吸收光谱，你如何理解它们之间的关系？
（3）比较阴生植物和阳生植物的叶绿素a和叶绿素b的比值有无不同。
