一.[目的要求]
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于0°C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42°C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
三.[教学内容]
1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介
2.CaCl2法制备 DH5a或JM109感受态细胞，计算转化效率
3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞
四.[实验材料和用品]
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等
五.[实验步骤]
一、 受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、 转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
六.[结果与分析]
１．计算转化率。
２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。
七.[问题与讨论]：
１．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？
２．抗性法筛选原理是什么？ |
