一.[目的要求]
1、通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术
2、学习和掌握酶切的相关知识和操作
二.[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三.[教学内容]
1.质粒载体基础知识、多种质粒提取方法的介绍
2.碱裂解法提取载体质粒、含目的片段质粒
3.根据需要EcoRI、BamHI、XhoI酶切所提取的质粒,包括部分酶切和完全酶切
四.[实验材料和用品]
恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pUC19、pGEX质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、EcoRI、BamHI、XhoI等限制性内切酶
五.[实验步骤]
见教材
六.[结果与分析]
质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。
七.[问题与讨论]
1.简述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用及加入后的现象.
2.简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因.
3.简述影响酶切的因素.
