一﹑[目的要求]
通过本实验学习重组DNA连接及鉴定重组子的方法。
二﹑[实验原理]
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做 重组子。重新组合的DNA分子是在连接酶的作用下进行连接的。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。如利用a互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。当外源基因插入lacZ基因中的多克隆位点后，将形成白色菌落从而与未插入外源基因的兰色菌落相区别。
三﹑[教学内容]
1.DNA重组知识介绍
2.分别回收纯化的外源DNA与酶切的载体分子并定量
3.按一定比例用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应。
4.介绍阳性克隆子的鉴定方法和技术
5.利用氨苄青霉素抗性
6.a互补现象
7.PCR法
8.酶切法进行阳性重组子的筛选
四﹑[实验材料和用品]
低温水浴锅、冰箱、T4连接酶、外源DNA与酶切的载体﹑超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、酶、IPTG、X-gal、LB培养基、氨苄青霉素等
五.[实验步骤]
见教材
六.[结果与分析]
观察菌落长出情况,并对结果进行分析.
七.[问题与讨论]
1.影响酶切效率的因素有哪些?
2.试述重组子鉴定的原理.
