一、[目的要求]
1.学习电场诱导酵母菌原生质体融合的原理。
2.掌握电场诱导酵母菌原生质体融合的步骤。
二、[基本原理]
电融合技术是1980年以来由Zimmermann等提出，并对几十种植物、微生物原生质体、动物细胞和脂质体广泛地进行电场诱导融合实验，为建立电融合技术机理的认识奠定了基础。近年来，这种物理融合技术迅速崛起，显示出强大的生命力。其原理是：在短时间强电场（高压脉冲电场、场强为kV／cm量级，脉冲宽度为us量级）的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟内恢复原状，当可逆电击穿发生在两相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。此法直观、定向、高效。主要用于替代难以进行化学物质诱导融合的情况中。
三、[实验材料]
（一）菌种
单倍体酿酒酵母Y-1 a trp- ade-（耐高温）、Y-4 a ura-。
（二）培养基（见附录二）
（1）完全培养基（液体、 CM）。
（2）完全培养基（固体、CM）。
（3）基本培养基（MM）。
（4）再生完全培养基（固体） 固体完全培养基加入0.5 mol／L蔗糖（或者1mol／L山梨醇）。
（5）再生基本培养基 固体基本培养基加入1mol／L山梨醇。
（三）缓冲液
1．脉冲液PM
山梨醇 1mol／L
CaCl2 10 mmol／L
MgCl2 0.4 mmol／L
用电导率小于5×10-6／Ω•cm的去离子水配制，自然pH。
2．0.2 mol/L磷酸缓冲液pH 5.8 见附录七。
3．0.2 mol／L磷酸高渗缓冲液（PB）
0.2 mol／L磷酸缓冲液pH 5.8加入0.8 mol／L山梨醇。
4．0.3％β-巯基乙醇液-0.1％ EDTA液
在PB溶液中加入0.1％EDTA灭菌后冷却至60～70℃时加入0.3％β-巯基乙醇。
5．1％蜗牛酶
PB溶液中加入1％蜗牛酶，细菌过滤器过滤除菌。
6．0.85％生理盐水，蒸馏水
（四）器皿
培养皿、移液管、试管、锥形瓶、烧杯、离心管、显微镜、台式离心机、722可见光分光光度计、细菌过滤器、电场诱导细胞融合仪等。
四、[实验内容]
（一）接种培养
从亲株Y-1和Y-4新鲜斜面菌种分别取一环接入装有液体完全培养基的试管中，30℃振荡培养18h，分别取1ml菌液接入装有20 ml液体完全培养基的250 ml锥形瓶中，30℃振荡培养8h，使细胞进入对数生长期。
（二）制备菌悬液
取两亲株上述菌液各5 ml，4000 r／min离心15 min，弃上清液，将菌体悬浮于PB缓冲液中，离心，如此洗涤两次，将菌悬浮于10 ml 0.2 mol／L磷酸缓冲液中，每ml约含108～109个活菌为适。
（三）总菌数测定
取菌液0.5ml，用生理盐水连续稀释至10-7、取10-5、10-6，10-7稀释液各1ml于无菌培养皿中，倾注固体完全培养基，30℃培养24h进行总菌数测定。
（四）脱壁
各取5 ml两亲株菌悬液，加入5 ml 0.1％β-巯基乙醇溶液，28℃预处理10 min，4000r／min离心15 min，弃上清，再在菌体中加入5 ml 1％蜗牛酶，30℃振荡处理50 min，随时取样镜检。当90％以上细胞已脱壁变为球状原生质体后，2000 r／min离心 10 min，收集原生质体用PM液洗涤两次。然后用PM溶液配成适当浓度的原生质体悬液备用。
（五）剩余菌数的测定
取0.5 ml原生质体悬液用无菌水作10倍稀释，分别取10-2、 10-3、10-4稀释液各0.1ml，涂布于完全培养基平板上，30℃培养24～48h，计算酶处理后剩余细胞数。
（六）原生质体再生
取0.5ml原生质体悬液，用PB液作适当稀释，分别取10-3、10-4、10-5稀释液各1ml至平皿中央，再倒入固体再生完全培养基混匀，30℃培养24～48h计算原生质体再生率，融合率计算公式参见实验有关部分。
（七）电场诱导原生质体融合
（1）分别取两亲本原生质体液各2ml，按1∶1的比例混合。
（2）用无菌移液管将混合后的原生质体液注入电融合小池，将小池置于显微镜的载物台上，接通正弦信号电源，经电解质电泳使原生质体形成稳定的串珠状。
（3）接通RC放电脉冲电路，输入单个脉冲，作可逆电击穿，触发原生质体融合。
（4）将融合小池取下，放入无菌操作台内，静止15 min，取出原生质体融合液，用PB液稀释至10-2，取100、10-1、10-2稀释液各1ml于无菌平皿内，倾入再生基本培养基混匀，30℃培养96h，挑取长出的大菌落。
（5）融合子的检验 用牙签挑取大菌落，点种在基本培养基平板上，长出的菌落便是融合子，在固体完全培养基上42℃连续培养传代15次选出耐高温的酿酒酵母。
五、[实验报告内容]
（一）写出酵母菌原生质体电融合的主要步骤。
（二）计算酿酒酵母Y-1、Y-4两亲本原生质体的形成率和再生率。
六、[思考题]
（一）电场诱导原生质体融合与化学融合原理有何不同？
（二）为何电融合过程所采用亲株在制备原生质体时需严格控制在对数期？
