一 粗脂肪的提取和定量测定─索氏提取法(比较不同生物组织中粗脂肪的含量)
一、目的和要求
1. 学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。
2. 学习和掌握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定。
3 将理论能用于实践当中:比较不同材料中所含粗脂肪的含量。
二、原理
脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物, 能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。
四、仪器设备及试剂
1、脱脂棉 2、镊子 3、分析天平 4、电热恒温水浴锅 5、恒温烘箱 6、索氏脂肪提取器 7、索氏脂肪提取仪 8、滤纸 9、干燥器 10 无水乙醚
五、步骤
1.抽提瓶在105℃±2℃烘箱中烘至恒重，材料干燥至恒重。
2.称取干燥后的材料1-2g,放入研钵中研磨(越细越好)将研磨好的材料用脱脂滤纸包住,用少许脱脂棉擦拭研钵壁上粘的材料及油脂,也一并放入滤纸包. 用棉线拴住滤纸包,将滤纸包放入抽提管，在抽提瓶中加入2/3体积的无水乙醚在70-75℃的水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次，或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。
3 取出试样，仍用原提取器回收乙醚直至抽提瓶全部吸完，擦净瓶外壁，将抽提瓶放入105℃±2℃烘箱中烘干至恒重。
六.计算
W1—W0
粗脂肪%=———— ×100
W
式中：W——样品重（g）
W0——提取瓶重（g）
W1——提取瓶和脂肪重（g）
七、注意事项
1．向滤纸筒内填装样品及回流提取过程中都不应外漏，否则重做。
2．应用无水乙醚，并在通风柜中进行蒸干，实验室内禁止明火与吸烟。
3．提取瓶中加入的乙醚不能少于1/2,也不能多余2/3。
二 蛋白质的含量测定
目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，,双缩脲法( Biuret法) ， Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质
一 凯氏定氮法
一 实验目的和要求
(1)掌握利用凯式定氮法测定生物材料中氮的含量和蛋白质的含量的方法
(2)理论用于实践中:比较不同的材料中蛋白质的含量
二 原理
样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:
1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4
反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3
NH3
R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O
2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。
反应式为: 2NH4++OH-==NH3+H2O
NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-
3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
三 实验试剂
HCI标准溶液（0.01 mol.L-1 ）
H3BO3溶液(2%)
H2SO4(浓)
NaOH溶液(30%)
K2SO4(固体)
CuSO4.5H2O(固体)
甲基红—溴甲酚绿混合指示剂
四 实验仪器:
凯氏烧瓶（100ml）:1个 50ml容量瓶
凯氏定氮装置 烘箱
移液管(10ml): 1支
酸式滴定管(10ml): 1支
分析天平
电炉
五 实验步骤
一、 消化液的制取
准确称取干燥样品0.5g，置于凯氏烧瓶内，加入0.2g(K2SO4,CuSO4.5H2O)混合物及15ml浓H2SO4，加数粒玻璃珠，缓慢加热，当硫酸分解开始放出二氧化硫白烟后，即加大火力至溶液澄清，再继续加热约1h，冷却至室温。沿瓶壁加入50ml纯水，溶解盐类，冷却，转入100ml容量瓶中，以纯水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，加水至刻度，摇匀。
二、NH3的固定
1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石 在整个蒸馏过程中需保持此液为橙红色，否则补加H2SO4。接收液为20ml 2%的H3BO4溶液，其中加2滴混合指示剂，接收时使装置的冷凝管下口浸入吸收液的液面之下先用蒸汽洗涤整个装置,约15分钟,用含指示剂的硼酸溶液检测装置是否洗干净。如果不变色才说明洗净了.
2、蒸馏:移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用少量水冲洗进样口，然后加入10ml 30% NaOH溶液于反应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时，自变色起再蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏，用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。
三、NH3的标定
用0.01mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。
四）计算
若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）则：
样品的总蛋白含量（克蛋白%）=
式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。
若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。首先需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后的样品的上清液中的含氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。
蛋白氮=总氮—非蛋白氮
蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25
二. 考马斯亮蓝法
1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.
考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合.
? 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比.
