一 实验目的和要求
1.学习和掌握胰蛋白酶的提取原理和方法
2学习对粗提的胰蛋白酶进行初步纯化的方法和含量测定的方法
二 实验原理
(1) 胰蛋白酶是以无活力的酶原存在于动物的胰脏中,酶原可以被肠激酶 钙离子活化或自我活化成为有活力的酶.,制备结晶的胰蛋白酶的基本方法是用硫酸铵分级盐析的方法
(2) ,胰蛋白酶在pH3最稳定,所以在制备过程中必须在冷处进行
(3) 含量测定可以用测定蛋白质的方法加上测定酶活力的方法
三 实验器材和药品
高速组织搅碎机, 组织匀浆机 大烧杯 抽滤泵 抽滤瓶
硫酸 乙酸 硫酸铵 胰蛋白酶
四 实验方法
1. 猪胰蛋白酶原的提取
称50猪胰脏（已剥去脂肪和结缔组织），剪碎后装入组织捣碎机内，加入150～200ml（以浸过捣碎机的刀片为准）预冷的乙酸酸化水。将猪胰脏捣碎（5s/次，间隔30s，共3次）。然后把匀浆转移到500ml烧杯中，在5～10℃提取4h以上。4层纱布过滤。滤液用2.5mol/L H2SO4调至PH2.5～3.0，静置2～4h。在静置期间要检查一下PH值，使PH值始终保持在PH2.5～3.0左右。然后滤纸过滤，收集滤液待激活。
2 盐析
滤液用0.75饱和度的硫酸铵进行盐析,边加边搅拌.盐析溶液静置过夜,次日于36000转/分,离心5-10分钟,收集的沉淀再在漏斗中抽滤,尽量除去滤液.称重滤饼,将滤饼溶于冰冷的蒸馏水中.
3. 胰蛋白酶原的激活
将滤饼液用5mol/L NaOH调节PH8.0，加入固体CaCl2使溶液Ca2+的终浓度达到0.1mol/L。然后，加入标准胰蛋白酶在4℃冰箱中激活12～16h左右或在室温下（20-25℃）激活2-4h(如未激活时可加入0.2g的固体酶在室温下激活每隔半个小时测一次活达800-1000BAEE单位/mg为止)。在h左右或在室温下（20～25℃）激活2～4h。在酶激活期间经常检测酶的活性，待酶的比活达到800～1000BAEE单位/mg时停止激活。用2.5mol/L H2SO4调至PH2.5～3.0，滤去CaSO4沉淀物滤液放置冰箱内备用
测定蛋白质含量(参照前面学习蛋白质测定的方法)
双缩脲（Biuret）法
在碱性溶液中，蛋白质分子能与铜离子结合生成紫红色的化合物（双缩脲反应），在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线形关系。因此可用比色法测定蛋白的含量。
福林—酚试剂法：
a 福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂
b 碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应
c 反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比。
紫外线吸收法
蛋白质中的Tyr、Try在280nm左右具最大吸收，且在各种蛋白质中Tyr、Try含量差别不大，280nm吸收值与浓度具正相关
