一 亲和层析法纯化胰蛋白酶
一 实验要求和目的
1 本实验要求掌握亲和层析的原理和方法；凝胶层析和离子交换层析技术；酶活性测定方法和抑制活性测定的原理和方法
2 利用上个实验中学习测定酶含量的方法测定纯化后的酶含量
二 基本原理
利用亲和层析(affinity of chromatography)技术纯化胰蛋白酶是一个综合性实验。首先从鸡卵清中分离胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶（sepharose-4B）上，制成鸡卵蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析方法从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶
本实验采用的是猪胰蛋白酶的天然抑制剂——鸡卵粘蛋白作为配基的。鸡卵粘蛋白是一种特异性胰蛋白酶抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用，但对糜蛋白酶无抑制作用。在PH7.6～8.0的范围内,猪或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上,在PH2.5～3.0的条件下,又能从鸡卵粘蛋白亲和吸附剂上洗脱下来。因此，采用鸡卵粘蛋白为配基合成的亲和吸附剂，可从猪胰脏的粗提取液中，通过亲和层析直接获得高纯度的猪胰蛋白酶，比活可心达到（1.5～2.0）×104BAEE单位/mg，相当于5次重结晶的胰蛋白酶的纯度，纯化效率可达到10～20倍以上
三 亲和层析分离纯化胰蛋白酶的步骤
1. 装柱与平衡
取一支层析柱（ 10×150mm）柱内先装入1/4体积的亲和柱平衡液，将脱气的亲和吸附剂轻轻搅匀，一次装入柱内，待其自然沉降，调好流速（2～4ml/10min）。用亲和柱平衡液平衡，经紫外分光光度计测定A280mm值小于0.02即可。
2. 上样与平衡
将已经激活的胰蛋白酶提取液用5mol/L NaOH精确调至PH8.0，过滤，取滤液20～50ml上柱(通过亲和介质的偶联量和胰蛋白酶粗提液的比活性，计算出上样所需体积) 上完样以后, 再以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 缓冲液(内含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡,洗去未被吸附的杂蛋白，直至流出的平衡液经蛋白质核酸检测仪绘出的基线稳定。
3. 洗脱
上柱后用亲和柱平衡液平衡，待流出液在经紫外分光光度计测定A280值小于0.02以后，改用亲和柱洗脱液（0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/L KCl溶液）洗脱。收集第Ⅱ洗脱峰。
注意经亲和层析获得的胰蛋白酶可以用两种方法，进一步制成结晶或干粉。
盐析法：向胰蛋白酶溶液中加入0.8饱和度的（NH4）2SO4，静置数小时，待沉淀后，抽滤，沉淀用少量的水溶解，加入1/4体积0.8mol/L,PH8.0硼酸缓冲液，精确调至PH8.0，放置冰箱内结晶。数日后在显微镜下观察到棒状的胰蛋白酶结晶，抽滤后干燥。该法需要有较多的酶液才能做结晶，否则无法得到结晶品。
冷冻干燥法：将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液装入透析袋内在低温下（4℃）对蒸馏水透析，然后经冷冻干燥成干粉即可。该法适合少量的胰酶的制备。使用过的亲和柱，经亲和柱平衡液平衡后可重复使用。也可将亲和吸附剂经蒸馏水洗净，加入0.01%NaN3于冰箱保存。
纯化后酶含量的测定:同上个实验中酶含量的测定方法同法测定
