一 实验目的和要求
1 熟悉酶动力学研究的实验原理
2 了解底物浓度 抑制剂 等因素对酶促反应的影响
3 学习测定米氏常数的方法
二 实验原理
(1) 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：
式中，v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；
V──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；
［S］──底物浓度（mol/L）；
Km──米氏常数（mol/L）。
这个方程表明当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01～100mmol/L。
Linewaeaver―Burk作图法（双倒数作图法）
是用实验方法测Km值的最常用的简便方法：
于是实验时可选择不同的［S］，测对应的v；
(2) 酶促反应速度受到各种因素的影响,一些能降低反应速度但不引起酶蛋白变性的一类化合物称为抑制剂.抑制剂对酶的抑制作用可分为可逆抑制剂和不可逆抑制剂.可逆抑制又分为竞争性抑制 非竞争性抑制及反竞争性抑制。根据米氏理论可推出酶抑制的动力学方程:
有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值随[I]的增高而增大；
在[E]固定时，当[S] ﹥﹥ Km (1+[I]/Ki), Km (1+[I]/Ki)项可忽略不计，则v= Vmax，即最大反应速度不变。
竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：如下
II. 非竞争性抑制：
酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。
如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。
非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除。
非竞争性抑制作用的速度方程：
有非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；Km值不变
非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：
III. 反竞争性抑制：
酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。
反竞争性抑制作用的速度方程：
有反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。
反竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：
本实验以胰蛋白酶为研究对象,通过测胰蛋白酶的米氏常数
及抑制剂苯甲脒对酶促反应的影响,了解酶促反应的动力学
的基本原理及动力学分析的基本实验方法.
胰蛋白酶能催化水解赖氨酸和精氨酸羧基所形成的肽键
通常以酪蛋白为底物测肽酶活力.用苯甲酰-L-精氨酰对硝基苯
胺,(BAPNA)和苯甲酰-L-精胺氨酰-b-萘酰胺(BANA)为底物测
酰氨酶活力.
本实验用BAPNA为底物,测胰蛋白酶的米氏常数值,反应最适
pH为8.1,BAPNA吸收高峰在315nm处.
二 实验设备和试剂
1设备
紫外分光广度计,恒温水浴锅,分析天平,秒表,移液器,试管等
2 试剂
0.1mol/L pH8.1 Tris.HCL缓冲液(含0.4% CaCl2)
1mmol/LDL-BAPNA(Mr=434.9)储存液
0.8mmol/L 0.6mmol/L 0.4mmol.LBAPNA应用液
0.2mmol/L 0.1mmol/LBAPNA应用液
1mmol/L苯加脒溶液
60%乙酸溶液
0.6mg/ml胰蛋白酶溶液
三 实验操作程序
1 米氏常数的测定
取12支试管并编号,然后按下表加试剂
编组号 相应底物最终浓度/mmol/L 使馆号 0.1mol/L pH8.1 Tris.HCL缓冲液(含0.4% CaCl2)/mL 各种浓度
底物溶液
1 0.05 1 1.6 0.1mmol/L2ml
2 1.5
2 0.1 3 1.6 0.2mmol/L2ml
4 1.5
3 0.2 5 1.6 0.4mmol/L2ml
6 1.5
4 0.3 7 1.6 0.6mmol/L2ml
8 1.5
5 0.4 9 1.6 0.8mmol/L2ml
10 1.5
6
0.5 11 1.6 1.0mmol/L2ml
12 1.5
上表中1357911号管为对照管,24681012号管为测定管,将上述加好试剂的试管
置30度恒温水浴中2分钟,平衡温度后,向测定管中加入0.1mL胰蛋白酶溶液,即
摇匀,计时反应2分钟后,立即向各管中加入0.4mL60%的乙酸溶液,终止反应,以
相应对照管做空白,在波长410nm下测定对应的各管的吸收值(A410).
2 抑制剂对胰蛋白酶水解速度的影响
取20支试管，编号，然后按下表（表7－2）加入试剂
K1测定加样顺序表：如下
组别 底物浓度/mmol/L 管号 缓冲液
/mL 加入底物浓度及体积 1mmol苯甲脒及终浓度 H2O
/µL
/mmol/L /mL /µL /mmol/L
Ⅰ
0.2 1
2
3
4
5 1.6
1.5
1.5
1.5
1.5
0.4
2.0 -
10
20
40
80 -
0.0025
0.005
0.010
0.020 100
90
80
60
20
Ⅱ
0.3 6
7
8
9
10 1.6
1.5
1.5
1.5
1.5
0.6
2.0 -
10
20
40
80 -
0.0025
0.005
0.010
0.020 100
90
80
60
20
Ⅲ
0.4 11
12
13
14
15 1.6
1.5
1.5
1.5
1.5
0.8
2.0 -
10
20
40
80 -
0.0025
0.005
0.010
0.020 100
90
80
60
20
Ⅳ
0.5 16
17
18
19
20 1.6
1.5
1.5
1.5
1.5
1.0
2.0 -
10
20
40
80 -
0.0025
0.005
0.010
0.020 100
90
80
60
20
表7-2中加入的缓冲液与表7-1中的相同
表7-2中1、6、11、16管为对照管，其余各管为测定管，每管加酶溶液0.1mL，其测定步骤与Km的测定相同。求得v后，用双倒数作图法，以不同浓度苯甲脒浓度（【I】）下的1/v对1/[S]作图，判断抑制剂类型，用Dixon作图法，以不同[S]浓度下的1/v对[I]作图；求Ki值（图7－5）
图7－5 Dixon作图法
随底物浓度[S]的增加，斜率减少
