一、实验目的
1、强化普通光镜结构和使用技能的知识，掌握让其发挥最佳效能的方法。
2、了解暗场显微镜、相差显微镜、荧光显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。
3、学会暗视场光挡的制作。
二、实验用品
材料与标本：载玻片、盖玻片、牙签，香柏油、生物永久装片、檫镜纸、荧光染料。
器材：光学显微镜，相差显微镜，荧光显微镜。
三、实验内容和方法
（一）普通光学显微镜的主要构造
普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学放大部分。
1.机械部分：（1）镜座。（2）镜柱。（3）镜臂。（4）镜筒。（5）物镜转换器(旋转器)。（6）镜台(载物台)。（7）调节器：①粗调节器(粗螺旋)，②细调节器(细螺旋)。
2．照明部分：包括反光镜，集光器。
3.光学部分：（1）目镜，（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。
在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：
物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm)
10× 0.25 5.40
40× 0.65 0.39
100× 1.30 0.11
表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物象调节清楚)时物镜的下表面与盖玻片(盖玻片的厚度一般为0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
物镜壳上还有其他的标志，如（1）物镜的种类；（2）标准机械筒长；（3）需用盖片情况；（4）物镜与被检样品间的介质等。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。
（二）显微镜使用中应强化的几个部分
1、 显微镜的能力：
显微镜的能力湿质量和性能的标志，它包括分辨力、放大力、焦点深度和视场宽度等，其中最重要的是分辨力。各种能力都有一定的界限，既相互作用，又相互制约，如总放大率超过物镜的数值孔径的1000倍时，微细结构即分辨不清，为空放大；低于500倍时由于放大率过低液分辨不清。所以，使用时应统筹考虑。
2、 光路的合轴调整
（1） 聚光器的调中；
（2） 物镜和目镜的选用于组合；
（3） 光阑及其使用。
（三）相差显微镜的构造、原理及使用方法：
1、 原理：相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，肉眼很难分辨，只有在变相差为振幅差（明暗差）之后才能被区分。
相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差）。 而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。
相差显微镜与普通光镜的不同之处在于它有四个特殊结构：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤光片。
生物学中使用的多为明反差相差显微镜。
2、操作：（演示）
（四）荧光显微镜的构造、原理和使用方法：
1、原理：落射光激发的荧光法（incident-loght fluorescence Epi-FL） 简称为落射荧光法，是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便，效率高，50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。
荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品，只要样品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光，而释放的荧光也会有特定的波长，因而用作特异性的鉴定十分有效，如某些致病的细菌和螺旋体，受紫外光激发后能发出它们特有的荧光，很容易作出鉴定，这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光，或吸收后不能释放荧光，但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料，而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光，再释放出特定的荧光，从而间接地鉴别出某种物质，这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。
2、调整方法：荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜，调整的方法大致相同。
（五）暗视场光挡的制作：
1、原理和结构特点
在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
2、 制作中央遮光板
普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。
（1）将显微镜聚光器调到最高位置，用低倍镜对好焦距。
（2）取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。
（3）用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片，放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。
（4）将中央挡光板放在滤光片框架上，开大光阑进行样品观察。
如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。
保存好各自制作的中央遮光板，以便在后面的实验中使用。
3、使用方法
（1）把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。
（2）选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。
（3）在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。
（4）升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。
（5）选用与聚光器相应的物镜，调节焦距(操作方法与普通显微镜相同)，找到所需观察的物像。
4、观察 观察示教台上暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗的背景里，可见细胞、细胞核和细胞器的衍射光图像。
