线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。
一、目的与要求
1、学习匀浆机和高速离心机的使用方法。
2、学习用差速离心法分离动，植物线粒体的方法，了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态，增加对线粒体的感性认识。
二、基本原理
线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。将组织匀浆后悬浮在等渗溶液中进行差速离心是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小，形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一个给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小，密度先后分批沉降在离心管的底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
分离线粒体的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。分离过程最好在0～5℃的条件下进行。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿B活染法。
三、实验用品:
1 器材: 显微镜, 高速离心机 玻璃匀浆机 剪刀 镊子 刀片 尼龙滤布 表面皿 载玻片 盖玻片 吸水纸
2 试剂：0.25mol/L蔗糖+0.01mol/LTris-盐酸缓冲溶液，
0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-盐酸缓冲溶液，
姬目萨染液，
1％詹纳斯绿B
3 材料：大鼠肝脏，猪肝或鸡肝
四、实验内容
1．线粒体的分离提取 2. 鼠肝的匀浆制备 3. 线粒体的活体染色
五、实验步骤
（一）动物组织线粒体的分离，提取与观察
1． 鼠肝线粒体的分离
（1）徒手切一小薄片 断头处死小鼠 （饥饿24小时，尽量将血放 肝，1/2000J.G.染色 尽剖腹）
30分钟 取肝 （取0.5克肝剪成小块，用4 ℃
PH7.5，0.25mol/L的蔗糖溶
细胞匀浆 液洗涤，去液后加5毫升蔗
糖液）
低速离心 （4 ℃，3000转/分，10分）
2．涂片2张，结晶紫染色 沉淀 上清夜（线粒体，溶酶体，微粒体等）
（核，细胞等）
高速离心 （4 ℃，11000转/分，15分 ）
3 加入适量4℃的蔗糖溶液，
混匀，即为线粒体悬液 沉淀 上清夜（溶酶体，微粒体等）
（线粒体粗制品）
4.加入适量的蔗糖溶液， 悬浮后高速离心
混匀，即为线粒体悬液
沉淀 去上清液
（线粒体）
镜检
显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2．组织培养细胞的线粒体的提取与观察
洗涤细胞
先倒去细胞培养瓶中的细胞培养液，用移液管按5ml/瓶加入无钙镁盐（CMF）( PH7.0)。
消化细胞
倒掉瓶中的CMF液，用移液管按5ml/瓶加入预先配好的胰蛋白酶—EDTA消化液（配比1：1，pH7.8）。并在室温或37℃条件下消化，并不时观察。
分散细胞
肉眼观察单层细胞出现裂隙时，倒去消化液，加入Hank׳s液（5ml/瓶），然后用移液管吸进液体，并贴壁细胞面吹出Hank’s液至分散完全为止。
细胞匀浆
用滴管将细胞悬液转移到置于冰浴的匀浆器外套管中，并在冰浴条件下匀浆（一般要5—6次以上）。
离心去核
用滴管将匀浆后的悬液，转移到玻璃离心管中，平衡后在3000r/min 条件下离心10分钟。
高速离心
用滴管吸取2/3上清液转移到冷冻高速离心机的离心管中，平衡后以10000r/min离心10～15分钟，倒去上清液，用滴管加入2～3mlHank’s液，悬浮平衡后再次离心15分钟。
悬浮收集
用滴管吸取少量Hank液，悬浮线粒体沉淀并转移到试管或离心管中，放于4℃冰箱或冰浴中保存。
染色，观察
用0.01Janus green B染液按基本等量的比例与线粒体悬液混合,在室温或冰浴中染色15~20分钟,用吸管吸取线粒体悬液,滴于载波片上,加盖玻片后,即可进行镜检,先在40倍镜下观察,然后换成油镜观察,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.
（三）操作中应该注意的问题
1． 整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。
2． 组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。（损失指细胞脱落到消化液中）。
3． 匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液
4． 匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。
5． 所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
6． 整个分离过程，一般最好在30—60分钟内完成，不宜过长。
六、习题
1． 叙述动物细胞线粒体的提取过程及其注意事项。
如何鉴定上述方法提取的最终产物是线粒体？
