一.目的要求：
1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。
2.初步认识细菌的形态特征。
3.巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。
4.学习并初步掌握革兰氏染色法。
5. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二.实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三.实验器材
3.1 菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
3．.2 染色剂
吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
3.3 仪器或其他用具
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。
四.方法步骤
（一）单染色步骤
1.流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
2 步骤
2.1 涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作（图2-1），分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
2.2 干燥
室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
2.3 固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 图 2-1 涂片、干燥和热固定
2.4 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。
5.5 水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
2.6 干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
2.7 镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
(二)革兰氏染色步骤
1 流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
2 步骤
2.1 涂片
2.1.1 常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2.1.2 “三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
2.2 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
2.3 媒染
用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。
2.4 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
2.5 复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
2.6 镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
2.7 实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
五、结果与思考
1作业
1.1绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。
1.2 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
1.3列表简述两株细菌的染色结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
2思考题
2.1 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2.2 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
2.3 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
2.4 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
2.5 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?
2.6 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
2.7 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
