一.目的要求
1．明确培养基的配制原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤
3.了解培养基的类型.
4.掌握常见培养基的配制方法.
5.了解常用的消毒灭菌方法.
6.掌握高压消毒灭菌器的使用方法和注意事项.
二.实验原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15—20g 水 1000ml pH 7．4—7．6 121℃ ，20～30分钟。
高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源），NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O（作为无机盐，为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子）和FeSO4• 7H2O（作为微生物的微量元素，提供铁离子）等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。对于象FeSO4•7H2O这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。 高氏1号培养基配方如下： 可溶性淀粉 20g NaCl 0．5g KNO3 1g K2HPO4•3H2O 0．5g MgSO4• 7H2O 0．5g FeSO4•7H2O 0．01g 琼脂 15—20g 水 1000ml pH 7．4—7．6。
马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4•7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4•7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 马丁氏培养基配方如下： KH2PO4 1g MgSO4•7H2O 0．5g 蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 琼脂 15—20g 水 1000ml pH 自然
此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3．3ml。临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0．3ml。
三.实验器材
1牛肉膏，蛋白胨， NaCl，琼脂； 1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O， FeSO4•7H2O，琼脂， 1mol/L NaOH， 1mol/ LHCl；KH2PO4，MgSO4•7H2O，蛋白胨，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素；
2试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（ pH 5．5—9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。
2．溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。
分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
附：棉塞的制作
棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染；二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状、大小、松紧与试管口（或三角烧瓶口）完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内，如图Ⅴ-3。棉塞的制作过程如图Ⅴ-4。 此外，在微生物实验和科研中，常要用通气塞。所谓通气塞，就是几层纱布（一般为8层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好通气促使菌体的生长或发酵。通气塞的形状如图Ⅴ-5。
五、实验报告
思考题
（1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？
（2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？图Ⅴ—5通气塞A．配制时纱布塞法；B．灭菌时包牛皮纸；C．培养时纱布翻出
（3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
(4）什么叫天然培养基？什么叫合成培养基？
（5）配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？
（6）什么是选择培养基？它在微生物学工作中有何重要性？
（7）培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的最适pH值各为多少？ |
