一.目的和要求
1.了解IMViC与硫化氢反应的。
2.掌握IMVIC与硫化氢试验在肠道菌裙鉴定中的作用。
二.基本原理
IMVIC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（methylred test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test，V．P．试验） 和柠檬酸盐试验（citrate test）的缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。
硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。
吲哚试验。有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。
色氨酸水解反应：
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：吲哚 对二甲基氨基苯甲醛 大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌阴性。
甲基红试验。某些细菌在糖代谢过程中，将培养基中的糖先分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂[pH4．2（红色）-6．3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。
伏-普试验。某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性，没有红色化合物产生则为阴性。其反应过程如下：产气肠杆菌伏-普反应阳性，大肠杆菌伏-普反应阴性。
柠檬酸盐试验。有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气肠杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，在有1%溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6．0时呈黄色，pH在6．0-7．6时为绿色，pH大于7．6时呈蓝色。
硫化氢试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物，从而可确定硫化氢的产生。 以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：
CH2SHCHNH2COOH+H2O→
CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑
H2S+Pb（CH3COO）2→PbS↓+2CH3COOH
（黑色）
大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。
三.实验器材
1.大肠杆菌，产气肠杆菌；
2.蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基；
3.甲基红试剂，40％KOH，5％α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。
四.操作步骤
1．接种与培养
(1)用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中，置37℃温室培养48小时。
(2)将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基中（做吲哚试验），置37℃温室中培养2天。
(3)将上述二菌分别接种于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中（做甲基红试验与伏-普试验），置37℃温室培养2天。
(4)将上述二菌分别接种入2支柠檬酸盐斜面培养基中。置37℃温室培养2天。
2．观察结果
(1)培养48小时后观察硫化氢产生情况。
(2)吲哚试验于培养48小时后的蛋白胨水培养物内加3—4滴乙醚，摇动数次，静置1—3分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
(3)甲基红试验培养48小时后，将葡萄糖蛋白胨水培养物分为两小管（其中一管留做伏-普试验），在一管内加甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。
(4)伏-普试验在上述留下的一小试管培养物中加入40%KOH5—10滴，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15—30分钟，以加快反应速度。若培养物呈现红色者，为伏-普反应阳性。
(5)柠檬酸盐试验培养48小时后观察柠檬酸盐培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。
五.实验报告
1．结果
将实验结果填入下表。“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。
2．思考题
(1)微生物生化反应的意义何在？
(2)甲基红试验和伏-普试验的最初作用物以及最终产物有何异同点？为什么会出现最终产物的不同？
