生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染。粪便污物含有不同类型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起传染病的发生。水源水如湖水、池水和溪水，常含有很多腐生菌，但仍可安全地饮用。然而水源一旦被粪便污染，就可能也被肠道病原体污染而引起肠道传染病甚至流行病，如霍乱、伤寒、细菌性痢疾和阿米巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染性肝炎等病毒性疾病。测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个项目：
一、细菌总数测定
水中细菌总数可说明被有机物污染的程度。细菌数越多，有机物质含量越大。细菌总数是指1ml水样在普通琼脂培养基中，37℃经24小时培养后，所生长的菌落数。我国规定自来水1ml的总菌数不得超过100个。
二、大肠菌群的测定
如前所述，若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群（coliform group），它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37℃24—48小时培养能产酸产气。根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。我国规定每升自来水中大肠菌群不超过3个；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内因尚无大量滤膜供应，故只有北京、天津、上海等水厂采用。
一.目的和要求
1. 学习水样的采取方法和平板菌落计数的原则。
2.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
3. 掌握水样细菌总数测定的方法。
4.掌握多管发酵法测定水中大肠杆菌数量的方法。
二.基本原理
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1．初（步）发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离
平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三.实验器材
1.肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；
2.乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；
3.灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四.操作步骤
(一) 水中细菌总数的测定
1．水样的采取
（1）自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2．细菌总数测定
（1）自来水
（a）用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。
（b）分别倾注约15ml已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
（c）另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，作空白对照。
（d）培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24小时，进行菌落计数。
两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。
（2）池水、河水或湖水等
（a）稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30—300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
（b）自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
（c）各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
（d）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。
3．菌落计数方法
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表ⅪⅤ-1，例1）。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30—300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数（见表ⅪⅤ-1，例2及例3）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例4）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例5）。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例6）。
（二）多管发酵法测定水中水中大肠菌群
1．水样的采取 （水中细菌总数的测定）
2．自来水检查
（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。
（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养 18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。
3．池水、河水或湖水等的检查
（1）将水样稀释成10-1与10-2。
（2）分别吸取1ml10-2、10-1的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有 5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0．1（10-1）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10-1）、0．01（10-2）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。
五.实验报告
（一）结果
1.水中细菌总数的测定
（1）自来水
（2）池水、河水或湖水等
2.多管发酵法测定水中水中大肠菌群
（1）自来水
100ml水样的阳性管数是多少？
10ml水样的阳性管数是多少？
查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？
（2）池水、河水或湖水
阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。
查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？
查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？
(二)思考题
（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？
（2）你所测的水源水的污秽程度如何？
（1）大肠菌群的定义是什么？
（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
